Con la finalidad de aumentar la tasa de aislamiento de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), a partir de muestras de fecas bovinas, se evaluó un nuevo procedimiento de descontaminación y cultivo de muestras fecales en 250 animales clínicamente sanos, provenientes de 14 rebaños infectados del sur de Chile. Para la descontaminación de las muestras previo al cultivo se utilizó una solución al 0.9% de cloruro de hexadecilpiridinio (HPC) y una solución antibiótica con amfotericina B, vancomicina y ácido nalidíxico. Para el aislamiento del agente se utilizó el medio de Herrold con yema de huevo y micobactina J adicionado de una solución antibiótica similar a la empleada para la descontaminación de las muestras. En el 16% (40) de las muestras analizadas fue posible aislar Map con un 7.6% de contaminación con hongos sólo a partir de la octava semana de incubación. La identidad de las cepas aisladas fue confirmada en el 100% de los casos mediante PCR, utilizando partidores específicos para este agente (P90 y P91). La alta tasa de aislamiento, la especificidad del medio de cultivo y la baja tasa de contaminación de los cultivos, durante el prolongado período de incubación, hacen de este procedimiento una buena alternativa de diagnóstico de Paratuberculosis bovina