El género Prosopis (Mimosoideae, Leguminosae) constituye un importante recurso genético de ambientes áridos y semiáridos. Prosopis chilensis (Molina) Stuntz es una especie multipropósito nativa de América del Sur que presenta una gran variabilidad fenotípica. En Chile, esta especie crece en la región semiárida, a lo largo de lechos de ríos de los valles transversales. En este trabajo se estudió la diversidad genética y la estructura genética de poblaciones de P. chilensis en los tres valles transversales de la Región de Coquimbo (29º-32ºS) mediante un análisis de diversidad genética de 182 individuos con cuatro marcadores de microsatélites nucleares y uno de cloroplasto. Utilizando un análisis espacial de componentes principales (sPCA), se detectó una clara estructura genética jerárquica. Este análisis reveló la existencia de siete grupos genéticos distintos en la región estudiada. Ninguno de los grupos genéticos detectados se superpuso entre los valles. Esto sugiere que las cadenas montañosas que separan los tres valles transversales pueden haber ejercido un efecto de barrera. Sin embargo, aunque significativa, la diferenciación genética de la población fue baja y la mayor parte de la variación genética se encontró dentro de los grupos. Estos resultados sugieren que un alto flujo génico podría estar contrarrestando y desdibujando el efecto de factores de estructuramiento. Este es el primer estudio de genética de poblaciones en P. chilensis en Chile y los datos genéticos obtenidos pueden ser de utilidad para la conservación de esta especie arbórea vulnerable y multipropósito.