La frutilla es una de las frutas de importante crecimiento económico tanto en Chile como a nivel Mundial. Desde hace varios años su producción haexperimentado pérdidas económicas, principalmente a causa de las enfermedades producidas por Fusarium oxysporum f.sp. fragariae (Fof). Este patógeno, se ha propagado rápidamente por casi todo el mundo debido a su difícil diagnóstico y actualmente la única manera dedetectarlo es mediante test de patogenicidad, técnica laboriosa que requiere de bastante tiempo y material, lo que dificulta su detección oportuna. Debido a que el diagnóstico genético y las técnicas moleculares son metodologías rápidas y altamente eficaces, el objetivo deeste trabajo fue diseñar un método para detectar a Fof, con el fin de controlar y certificar el ingreso o salida del país de este patógeno.Para esto se amplificó el gen «Factor de Elongación 1-α» (EF1-α), en 25 cepas de F. oxysporum aisladas desde diversas localidades de la VIII región y R. Metropolitana, 4 cepas otorgadas por el laboratorioNacional del Servicio Agrícola y Ganadero (SAG), y 4 cepas patogénicas controles importadas desde ATCC, EE.UU. Posteriormente por digestión con endonucleasas MseI y MspI se logró diferenciar las cepas de Fusarium oxysporum f.sp. fragariae de las respectivas cepas nopatogénicas de este hongo. Estos resultados fueron confirmados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida denaturante, RFLP con dos endonucleasas y parcialmente mediante secuenciación delproducto amplificado de Fof, revelándose de esta manera la eficacia de esta metodología.