En este trabajo se describe la preparación y regeneración de protoplastos a partir de cultivos frescos de la levadura carotenogénica Phaffia rhodozyma, en forma eficiente y con un alto grado de rendimiento en la sobrevida de las células tratadas. Para ello se han realizado una serie deexperimentos para formar protoplastos de P.rhodozyma, utilizando tres cepas silvestres y cinco cepas afectadas en carotenogénesis. Se probó las enzimas bioglucanasa, biocelulasa, bioxilanasa, glucuronidasa, zimoliasa 100T, lisozima y novozima 234, encontrándose que novozima 234, es la que tiene mayor eficiencia. En las cepas silvestres UCD 67-210 y UCD 67-385 y las cinco cepas de color, se logra un 100% de  protoplastos entre 60 a 90 minutos de tratamiento con novozima a 37ºC. Sin embargo, no fueposible formar protoplastos en ninguna de las condiciones estudiadas con la cepas silvestre UCD 67-383. Tales resultados pueden ser debidos a diferencias en la pared celular entre dichas cepas. Además, se ha observado que la incubación a 37ºC reduce notablemente la sobrevida de las células tratadas. Para la formación y regeneración de protoplastos se utilizó una serie de condiciones, encontrando que en sorbitol 0.2 M la destrucción de las células es menor que a concentraciones de sorbitol 0.8 y 1 M. Sin embargo, el medio más adecuado para la formación y regeneración de los protoplastos debe contener KCl 0.8 M como agente osmolar, manteniendo la isotonÍa del medio y logrando que la destrucción celular sea menor.