La identificación precisa de insectos tiene un rol primordial en la asignación específica de plagas que afectan los cultivos, siendo las similitudes morfológicas en muchas especies el gran reto que enfrentan los entomólogos, es por esto que las metodologías basadas en ADN son utilizadas como complemento a los métodos morfológicos. El espárrago (Asparagus officinalis) es el cultivo de mayor importancia económica en el Perú, en donde el insecto polífago Prodiplosis sp. (Diptera: Cecidomyiidae) es su principal plaga, mermando la producción hasta 50%. En el presente estudio se utilizó el ADNmt de Prodiplosis sp. para la identificación molecular y análisis de diversidad en 34 larvas colectadas de los cultivos de Asparagus officinalis, Capsicum annuum y Citrus spp. Fragmentos de 490 pb y 712 pb del gen de citocromo oxidasa I fueron amplificados por PCR seguidos de secuenciamiento directo. La divergencia de las secuencias nucleotídicas utilizando el modelo de distancia Kimura dos parámetros, muestra la conformación de dos clados agrupados indistintamente del hospedero. El análisis de diversidad genética en la población, dentro de las poblaciones y entre poblaciones fue de 0,019; 0,005 y 0,014, respectivamente, mostrando escasa divergencia, la variabilidad dentro de los grupos y entre grupos fue 26,7% y 73,3%. Los resultados del análisis AMOVA entre poblaciones (-1,13%) y los valores estadísticos (0,01129) fueron bajos, lo que se explica por el alto flujo de genes Nm (43,79), sugiriendo que los cultivos en estudio están afectados por una misma plaga con dos haplotipos (h1: TC y h2: GT). En conclusión, basados en la sensibilidad y especificidad de la PCR sumados a la información en las secuencias del ADNmt se puede sugerir que la prueba desarrollada serviría complementariamente a la identificación morfológica y puede ser aplicada en estudios de diversidad genética de Prodiplosis sp. en otros cultivos.