Se desarrolló y validó un método por cromatografía planar instrumental (HPTLC) empleando una cámara de desarrollo múltiple automático (AMD), para la determinación de colesterol libre en yema de huevos con bajo contenido de colesterol. Se estableció el gradiente que permitió la separación, identificación y cuantificación simultánea de colesterol, fosfatidilcolina y trioleina. Se evaluó el porcentaje de recuperación a través de un procedimiento de adición estándar de colesterol con un rendimiento de 99,4%. La Repetibilidad y Repetibilidad intermedia resultaron adecuadas sobre la base del análisis de diferencia de medias a un nivel del 95% de confianza.