We evaluated the effect of three variables (cryoprotectant temperature, light regime, and time of exposure to the cryoprotectant) throughout the equilibrium period during cryopreservation on the viability of the microalga Chaetoceros calcitrans (Paulsen). For this, the cryoprotectant dimethyl sulfoxide (DMSO) at 5% (v/v) was added at three different temperatures (4, 10, and 25ºC) before placing the microalgae in cryobiological straws for freezing. Once inside the cryobiological straws, the microalgal-cryoprotectant suspensions were subjected to the following light regimes for 15 or 45 min: complete light, complete darkness, light/darkness, and darkness/light. Suspensions were then frozen under controlled conditions and stored in liquid nitrogen. The viability index proposed by Cañavate & Lubian (1995b) was used to measure microalgal viability after cryopreservation. Results indicated that it is necessary to use a cryoprotectant to ensure the viable cryopreservation of C. calcitrans. Statistical analyses showed that the temperature of the DMSO influenced the viability of cryopreserved microalgae and that there was no synergistic effect between the other variables studied. The viabilities obtained with DMSO at 25ºC, 10ºC, and 4ºC were 34.9%, 27.8%, and 20.6%, respectively.Se evaluó el efecto de tres variables - la temperatura del crioprotector, el régimen de luz y el tiempo de exposición al crioprotector durante el período de equilibrio en el proceso de criopreservación - sobre la viabilidad de la microalga Chaetoceros calcitrans (Paulsen). Para ello se utilizó, el crioprotector dimetilsulfóxido (DMSO) al 5% (v/v), el cual fue adicionado a tres temperaturas diferentes (4, 10 y 25ºC) antes de que las microalgas fueran introducidas dentro de pajuelas criobiológicas para su congelación. Una vez dentro de las pajuelas, las suspensiones de microalgas con crioprotector se sometieron durante 15 o 45 min a luz completa, oscuridad completa, luz/oscuridad y oscuridad/luz. Luego se congelaron de manera controlada y se almacenaron en nitrógeno líquido. La viabilidad de las microalgas posterior a la criopreservación fuemedida a través del índice de viabilidad propuesto por Cañavate & Lubian (1995b). Los resultados indicaron que es necesario el uso de criprotector para la criopreservación viable de C. calcitrans. El análisis estadístico demostró que la temperatura del DMSO influye sobre la viabilidad de la microalga criopreservada y que no existe efecto sinérgico entre las demás variables de estudio. Las viabilidades alcanzadas usando DMSO a 25ºC, 10ºC y 4ºC fueron de 34,9%, 27,8% y 20,6% respectivamente.