Palabras clave: microsatélites, alelos, heterocigosidad, índice de endogamia.La raza Holstein es la que más contribuye a la producción láctea en Ecuador. Sin embargo, no existen datos de parámetros genéticos que describan las características de los hatos lecheros del país. Por ello, el objetivo de este trabajo fue analizar la variabilidad genética de bovinos registrados de la raza Holstein en el cantón Cuenca, Ecuador. Para ello se analizaron los marcadores microsatélites CSRM60, INRA083, CSSM66, ETH3, HEL9, TGLA53, BM1818, LSTS006, BM2113, ETH225, TGLA122, ETH10, TGLA227, INRA032 y SPS115 en 52 bovinos, de acuerdo a lo sugerido por la FAO para la caracterización genética de poblaciones de animales domésticos. Se encontró en promedio 8,4 ± 1,88 alelos y una frecuencia de 0,08 ± 0,056 de alelos nulos. Los valores de heterocigosidad observada y esperada alcanzaron 0,68 ± 0,13 y 0,82 ± 0,07, respectivamente. El contenido de información polimórfica osciló entre 0,70 y 0,88, y el coeficiente de endogamia varió entre -0,38 y 0,45. De los 15 locis analizados, solamente el CSSM66 presentó equilibrio Hardy-Weinberg, y 4 de ellos mostraron un alto nivel de endogamia. Se concluye que los loci estudiados muestran una alta variabilidad genética y alto polimorfismo. Esto ofrece amplia información para los estudios de paternidad e identidad. No obstante, de acuerdo al nivel de consanguinidad debe considerarse la selección de una alta diversidad de toros para los programas de inseminación artificial.