El propóleos es una substancia fabricada por Apis mellifera y ha sido utilizado ampliamente en la medicina popular debido a su alta concentración de compuestos bioactivos. El propósito del siguiente estudio fue caracterizar y evaluar in vitro las propiedades antimicrobianas del propóleos sobre muestras clínicas y cepas ATCC. La caracterización química de propóleos presenta una concentración de polifenoles totales de 247 ± 9 mg EAG g-1 de MS, flavonas y flavonoles 75 ± 4 mg EQ g-1 de MS, flavanononas y flavanonoles 118 ± 11 EP g-1 de MS. Mediante HPLC-DAD se identificó apigenina, galangina, fenetil éster del ácido cafeico y pinocembrina, además de 16 compuestos mediante HPLC MS/MS. El propóleos chileno es un antimicrobiano natural, observándose efectividad en cepas ATCCStaphylococcus aureus, Candida albicans, Trichophyton rubrum y muestras clínicas de Staphylococcus aureus a diferencia de Escherichia coli. Estos resultados demuestran la efectividad antimicrobiana de la sinergia de compuestos presentes en el propóleos ante diferentes patógenos humanos.