Objetivo: Avaliar se a higienização das mãos realizada antes do preparo e da administração de medicamentos e fuidoterapia pelos profissionais de enfermagem segue as diretrizes estabelecidas pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Material e método: Estudo quantitativo exploratório descritivo realizado de agosto a novembro de 2010, cuja coleta de dados foi implantada por meio da observação direta da higienização das mãos em uma unidade de internação pediátrica de um Hospital Universitário do Sul do Brasil, nos turnos manhã e tarde. Resultados: Constatou-se a baixa adesão à prática de higienização das mãos e estrutura inadequada, segundo as diretrizes estabelecidas pela OMS e ANVISA. Considerações finais: Há necessidade de se reestruturar o espaço físico e fornecer condições favoráveis para realização das técnicas de higienização das mãos pelos profissionais. Como também promover capacitação e educação continuada, garantindo, assim, a segurança do paciente pediátrico por meio da higienização das mãos.