Yerba mate (Ilex paraguariensis) produces several secondary metabolites of interest to the pharmaceutical industry, such as chlorogenic acids and methylxanthines. These compounds have been produced in vitro by callus culture from different species. However, for I. paraguariensis, no studies upon the production of these compounds in vitro have been performed to date. In this work, we show that the concentration of secondary metabolites from I. paraguariensis callus is possible and highly dependent on the callus growth phase. We observed that the best phase for the production of secondary compounds in calli of yerba mate is the stationary growth phase on both genotypes tested. In this phase, higher levels of phenolic compounds, chlorogenic acid and 3,5-dicaffeoylquinic acid and greater antioxidant activity were observed. Chlorogenic acid and 3,5-dicaffeoylquinic acid presented positive correlation with antioxidant activity. For the first time, secondary compounds were reported in yerba mate calli cultivated in vitro.La yerba mate (Ilex paraguariensis) produce varios metabolitos secundarios de interés para la industria farmacéutica, como los ácidos clorogénicos y las metilxantinas. Estos compuestos se han producido in vitro mediante cultivo de callos de diferentes especies. Sin embargo, para I. paraguariensis, hasta la fecha no se han realizado estudios sobre la producción de estos compuestos in vitro. En este trabajo, mostramos que la concentración de metabolitos secundarios desde callos de I. paraguariensis es posible y altamente dependiente de la fase de crecimiento del callo. Observamos que la mejor fase para la producción de compuestos secundarios en callos de yerba mate es la fase de crecimiento estacionario en ambos genotipos probados. En esta fase se observaron niveles más altos de compuestos fenólicos, ácido clorogénico y ácido 3,5-dicafeoilquínico y una mayor actividad antioxidante. El ácido clorogénico y el ácido 3,5-dicafeoilquínico presentaron correlación positiva con la actividad antioxidante. Por primera vez, se reportaron compuestos secundarios en callos de yerba mate cultivados in vitro.